Sicurezza preclinica e biodistribuzione di CRISPR mirato al SIV in soggetti non

Terapia genica (2023) Cita questo articolo

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In questo studio, dimostriamo la sicurezza e l’utilità della tecnologia di editing genetico CRISPR-Cas9 per l’editing in vivo del DNA provirale nei macachi rhesus infetti dal virus dell’immunodeficienza scimmiesca (SIV) trattati con ART e viralmente controllati, un modello consolidato per l’infezione da HIV. EBT-001 è un vettore basato su AAV9 che fornisce SaCas9 e RNA a doppia guida progettati per colpire più regioni del genoma SIV: le LTR virali e il gene Gag. I risultati qui presentati dimostrano che una singola inoculazione IV di EBT-001 a ciascuno dei 3 livelli di dose (1,4 × 1012, 1,4 × 1013 e 1,4 × 1014 copie di genoma/kg) ha prodotto un'ampia e funzionale biodistribuzione di AAV9-EBT-001 a noti serbatoi tissutali di SIV. Non sono stati osservati effetti fuori bersaglio o patologie anomale e gli animali sono tornati al loro peso corporeo normale dopo aver ricevuto EBT-001. È importante sottolineare che i macachi che hanno ricevuto le due dosi più elevate di EBT-001 hanno mostrato un miglioramento della conta assoluta dei linfociti rispetto ai controlli trattati con antiretrovirali. Nel loro insieme, questi risultati dimostrano la sicurezza, la biodistribuzione e l’editing del DNA provirale in vivo dopo la somministrazione endovenosa di EBT-001, supportando l’ulteriore sviluppo dell’editing genetico basato su CRISPR come potenziale approccio terapeutico per l’HIV negli esseri umani.

I primati non umani (NHP) sono stati utilizzati per comprendere l’infezione lentivirale, la patobiologia, la patogenesi e per prevederne l’efficacia clinica fin dall’inizio della pandemia di HIV, e recentemente per valutare strategie di eradicazione e approcci innovativi per curare l’HIV [1,2,3] . Negli studi qui presentati, abbiamo impiegato macachi rhesus indiani trattati con antiretrovirali (ART) infetti dal virus dell'immunodeficienza scimmiesca (SIV) per valutare la biodistribuzione, la sicurezza e la capacità del trattamento di editing genetico CRISPR/Cas9 (EBT-001) di colpire i SIV somministrato in una singola infusione in bolo endovenoso (IV) [4]. EBT-001 (codifica gli RNA guida per il targeting dell'HIV) è l'omologo scimmiesco di EBT-101 (codifica gli RNA guida per il targeting dell'HIV) ed è composto da un costrutto CRISPR tutto in uno incapsulato dal sierotipo 9 del virus adeno-associato (AAV9) che esprime simultaneamente il Endonucleasi SaCas9 e RNA a doppia guida (gRNA) mirati alle ripetizioni terminali lunghe (LTR) virali e al gene Gag. EBT-101 è progettato per la rimozione di grandi sequenze di DNA SIV provirale integrato interposte posizionate tra i siti target CRISPR previsti, generando così 3 possibili delezioni: da 5′LTR a Gag, da Gag a 3′LTR e da 5′LTR a 3′LTR . L'uso della consegna di AAV9 è supportato dai nostri studi iniziali su modelli animali piccoli e grandi, oltre a un ampio insieme di prove provenienti da precedenti studi clinici sulla terapia genica in cui AAV9 ha mostrato sicurezza, efficacia e ampie proprietà di biodistribuzione [4,5,6] . Qui presentiamo dati più completi sulla sicurezza, comprese analisi approfondite fuori target e biodistribuzione di dosi multiple (1012, 1013, 1014 GC/kg) di EBT-001 e uno studio esteso (3 e 6 mesi) in un macaco rhesus indiano Modello SIV. Questo studio preclinico su sicurezza, biodistribuzione ed efficacia ha dimostrato che una singola somministrazione endovenosa di EBT-001 per l'editing SIV è stata ben tollerata e può raggiungere ed asportare ampiamente i serbatoi virali nei NHP senza alcun effetto fuori bersaglio osservato. Questi risultati supportano il fatto che una singola inoculazione IV di EBT-101 per l’editing del gene dell’HIV può essere utilizzata per raggiungere i serbatoi virali nei tessuti infetti in tutto il corpo per l’editing in vivo sicuro e specifico del DNA provirale dell’HIV latente.

Questo studio è stato approvato dallo IACUC di BIOQUAL, protocollo numero 18-036. Dodici macachi indiani maschi di macaco rhesus (Macaca mulatta) sono stati ottenuti dal Caribbean Primate Research Center di Porto Rico. Sono stati condotti due studi. Il primo era un n = 10 con animali randomizzati da uno statistico in quattro gruppi di trattamento di cui 3 non trattati, 3 trattati con 1,4 × 1012 GC/kg EBT-001 e 4 trattati con 1,4 × 1013 GC/kg EBT-001 (2 sottoposti a necroscopia a 3 mesi e 2 a 6 mesi dopo l'EBT-001). La randomizzazione è stata effettuata utilizzando un metodo di randomizzazione a blocchi permutati con la restrizione che gli animali accoppiati con i partner sociali fossero nello stesso gruppo. Il secondo studio prevedeva un n = 2 utilizzando una dose di EBT-001 superiore di 1 log pari a 1,4 × 1014 GC/kg e in questo caso non è stata eseguita alcuna randomizzazione. Tutti gli animali sono stati sottoposti a screening e sono risultati triplo negativi per Mamu-A*01, Mamu-B*08 e Mamu-B*17. Tutti i macachi rhesus sono stati ricevuti presso la struttura Piccard Drive di BIOQUAL, a Rockville, MD, dove sono stati eseguiti tutti gli studi in vivo qui descritti. I macachi rhesus sono stati pre-selezionati sierologicamente per retrovirus (STLV e SIV), virus SA8, virus SHF e virus del morbillo prima dello studio. Gli animali sono stati infettati con SIVmac239 (un regalo del Dr. Preston Marx, Tulane Primate Center). Gli animali sono stati avviati con un regime ART giornaliero di tenofovir (TDF; #T018500; 15 mg/kg/animale), emtricitabina (FTC; #E525000; 50 mg/kg/animale) e dolutegravir (DTG; #D528800; 2,5 mg/animale). kg/animale) (Toronto Research Chemicals) a partire dal giorno 28 dopo l'infezione e continuato con la necroscopia. Negli animali è stata osservata la morbilità, la mortalità, le lesioni e la disponibilità di cibo e acqua. Tutti gli animali in cattive condizioni di salute sono stati identificati per ulteriore monitoraggio, trattamento clinico ed eventuale eutanasia. Le osservazioni includevano, ma non erano limitate a, valutazione della pelle, del pelo, degli occhi, delle orecchie, del naso, della cavità orale, del torace, dell'addome, dei genitali esterni, degli arti e dei piedi, effetti respiratori e circolatori, effetti autonomici come la salivazione, effetti sul sistema nervoso inclusi tremori, convulsioni, reattività alla manipolazione, effetti neurologici/comportamentali e comportamenti insoliti. La carica virale SIV (limite di rilevamento di 50 copie/mL) è stata misurata nel plasma di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) nel corso dell'infezione (materiale e metodi supplementari). Il sangue intero è stato raccolto in più giorni durante il periodo di studio e inviato a IDEXX BioAnalytics, Inc. per l'analisi emocromocitometrica completa (CBC) e per gli esami chimici del sangue. Agli animali è stato somministrato EBT-001 6 mesi dopo l'infezione da SIV con un'infusione endovenosa lenta a una velocità di 1 ml/min. La quantità di vettore EBT-001 da dosare è stata aggiunta a un totale di 100 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1X per ciascun animale in base al peso corporeo e alla dose attuali (Tabella S2). Gli animali sono stati sottoposti a una necroscopia completa a 3 mesi o 6 mesi dopo l'infusione di EBT-001 (materiale e metodi supplementari). Presso BioQual non è stato effettuato alcun occultamento dei raggruppamenti di animali.