Progettazione e validazione di primer PCR specifici per Dolosigranulum pigrum utilizzando il genoma del core batterico

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 6110 (2023) Citare questo articolo

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Dolosigranulum pigrum – un batterio dell’acido lattico sempre più riconosciuto come un membro importante del microbioma nasale. Attualmente esistono opzioni limitate, rapide e a basso costo, per confermare gli isolati di D. pigrum e rilevare D. pigrum nei campioni clinici. Qui descriviamo la progettazione e la validazione di un nuovo test PCR mirato a D. pigrum che sia sensibile e specifico. Abbiamo progettato un test PCR mirato a murJ, un gene di specie core a copia singola identificato attraverso l'analisi di 21 sequenze del genoma intero di D. pigrum. Il test ha raggiunto una sensibilità e una specificità del 100% contro D. pigrum e diversi isolati batterici e una sensibilità complessiva del 91,1% e una specificità del 100% utilizzando tamponi nasali, rilevando D. pigrum a una soglia di 1,0 × 104 copie del gene dell'rRNA 16S di D. pigrum per tampone. Questo test aggiunge uno strumento affidabile e rapido per il rilevamento del D. pigrum al kit di strumenti del ricercatore sul microbioma che studia il ruolo dei batteri generalisti e specialisti nell'ambiente nasale.

Il Dolosigranulum pigrum è un batterio Gram-positivo non sporigeno della famiglia delle Carnobacteriaceae1 comunemente presente nella cavità nasale umana2,3. Descritto per la prima volta nel 1993 come piccole colonie bianche che mostravano beta-emolisi1, D. pigrum rimane poco conosciuto ed è l'unica specie di Dolosigranulum conosciuta fino ad oggi. Epidemiologicamente, D. pigrum è stato associato allo stato di salute del microbioma nasale3,4. Nello specifico, la colonizzazione delle vie aeree superiori da parte di D. pigrum è associata negativamente al trasporto di Staphylococcus aureus5,6,7,8,9. Più recentemente, è stato riscontrato che D. pigrum è presente in maggiore abbondanza nel rinofaringe dei pazienti con infezioni asintomatiche da SARS-CoV-2 rispetto ai pazienti con sintomi più gravi10.

Sono necessari metodi rapidi ed economici per l'identificazione di D. pigrum per facilitare futuri studi clinici e in vitro. I metodi biochimici standard sono costosi e richiedono molto tempo, così come i metodi basati sul sequenziamento. L'analisi del tempo di volo di desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF) è economicamente vantaggiosa, ma non può essere utilizzata per rilevare D. pigrum direttamente da campioni clinici. Utilizzando un approccio basato sul core-genoma, abbiamo progettato e convalidato un test basato sulla PCR che può essere utilizzato per confermare gli isolati di D. pigrum e rilevare la presenza di D. pigrum direttamente dai campioni clinici.

Abbiamo prima analizzato la diversità genetica di 21 sequenze del genoma intero di D. pigrum disponibili (n = 7 da NCBI e n = 14 da genomi interni di D. pigrum, Tabella S1). Abbiamo estratto 87.993 SNP da regioni non ricombinate del genoma centrale ed esaminato la diversità genetica in base alla filogenesi di massima verosimiglianza (Figura S1). Ciò ha mostrato più lignaggi distinti di D. pigrum, il che indica sia la natura non clonale di D. pigrum sia la robustezza della raccolta del genoma. Abbiamo quindi generato e analizzato il pan-genoma di D. pigrum per identificare 1291 geni principali e 357 geni accessori. Per i potenziali bersagli del test, ci siamo concentrati sui geni core 1291.

La scoperta dei geni bersaglio del test è stata un processo in più fasi (Fig. 1). Abbiamo rimosso i geni ribosomiali (n = 71) e i geni con omologhi in altri generi (n = 345). È stato eseguito il filtraggio manuale dei geni bersaglio del test scelti casualmente dagli 843 geni delle specie core a copia singola, richiedendo che il gene bersaglio del test: (a) deve essere presente in tutti i 21 genomi di D. pigrum, (b) deve avere meno di 70 % di identità di somiglianza e copertura contro sequenze di taxa non Dolosigranulum secondo BLAST, (c) contengono sequenze di primer diretti e inversi che soddisfano i criteri di progettazione Primer3 e che hanno meno del 50% di identità di somiglianza e copertura contro sequenze di taxa non Dolosigranulum secondo BLAST.

Approccio basato sul genoma centrale per la progettazione dei test. Rappresentazione schematica dell'approccio adottato per estrarre il pan-genoma per obiettivi di analisi. Ogni passaggio successivo nel flusso di lavoro dell'analisi del pangenoma illustra come i geni sono stati filtrati per conservare infine un genoma centrale unico per l'organismo di interesse.