Influenza del solfuro sulla crescita diazotrofica del metanogeno Methanococcus maripaludis e sue implicazioni per l'origine della nitratosi

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 799 (2023) Citare questo articolo

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I metanogeni abitano ambienti euxinici (ricchi di solfuri) o ferruginosi (ricchi di ferro) che promuovono la precipitazione di metalli di transizione come solfuri metallici, come la pirite, riducendo la disponibilità di metallo o zolfo. Tali ambienti sono stati comuni nel corso della storia della Terra, sollevando la questione su come gli anaerobi ottengono questi elementi per la sintesi di cofattori enzimatici. Qui, mostriamo che un metanogeno può sintetizzare i metallocofattori della molibdeno-zozotasi dalla pirite come fonte di ferro e zolfo, consentendo la fissazione dell'azoto. Le cellule coltivate con pirite e che fissano l'azoto crescono più velocemente e richiedono 25 volte meno molibdeno rispetto alle cellule coltivate in condizioni euxiniche. I rendimenti di crescita sono da 3 a 8 volte superiori nelle colture coltivate in condizioni ferruginose rispetto a quelle euxiniche. Dati fisiologici, trascrittomici e geochimici indicano che queste osservazioni sono dovute alla limitazione dei metalli promossa dai solfuri, in particolare del molibdeno. Questi risultati suggeriscono che la molibdeno nitratosi potrebbe aver avuto origine in un ambiente ferruginoso che ha titolato il solfuro per formare pirite, facilitando la disponibilità di ferro, zolfo e molibdeno sufficienti per la biosintesi dei cofattori.

L'azoto (N) è essenziale per la sintesi degli acidi nucleici, degli amminoacidi e di altre biomolecole chiave in tutte le forme di vita. Il più grande serbatoio di N della Terra è il gas diazoto (N2) nell'atmosfera; tuttavia non è biodisponibile e deve essere fissato al nitrato (NO3-) o all'ammoniaca (NH3) prima della sua assimilazione. Pertanto, la disponibilità di N fisso spesso limita la produttività degli ecosistemi1. Sulla Terra primordiale, si pensa che l’N fisso sia stato fornito da processi abiotici come l’ossidazione basata sui fulmini dell’N2 atmosferico o la riduzione minerale dell’N22,3. Tuttavia, l’N fisso proveniente da queste fonti sarebbe stato minimo e finito e si ritiene che, insieme, queste caratteristiche abbiano limitato la produttività dell’ecosistema durante questo periodo1. Oggi, circa il 50% di tutto l'azoto fisso viene generato attraverso il processo biologico di fissazione dell'azoto1,4, per cui l'azoto viene ridotto a NH3 dall'enzima azotato (diazotrofia) mentre l'azoto fisso rimanente viene in gran parte generato attraverso il processo industriale Haber-Bosch.

Finora sono state descritte tre diverse forme di nitratosi, differenziate per gli (etero)metalli che costituiscono il sito attivo di ciascun complesso enzimatico5. Ciò include forme di nitratosi contenenti solo molibdeno (Mo), vanadio (V) e ferro (Fe)6,7. La mo-nitrogenasi (Nif) è tassonomicamente la forma più ampiamente distribuita e più antica di nitrogenasi8,9 e, come minimo, è costituita dalle proteine strutturali NifHDK e dalle proteine maturasi, NifB(E)N10. Il metallocluster del sito attivo di Nif comprende un nucleo di sei atomi di ferro (Fe) e nove di zolfo (S) con Fe che coordina simmetricamente un atomo di carbonio centrale; il metallocluster è ricoperto da atomi di Fe e Mo [7Fe-Mo-9S] (chiamato cofattore FeMo10,11). Oltre ai cofattori FeMo, Nif richiede il complesso cluster P costituito da otto atomi di Fe e sette atomi di S [8Fe-7S]12. Un cofattore FeMo è ospitato all'interno di ciascuna proteina strutturale NifD, mentre il cluster P si trova all'interfaccia di ciascun NifD e NifK, formando infine l'eterotetramero, NifD2K213. La dinitrogenasi reduttasi, NifH, modula il trasferimento di elettroni dipendente dall'ATP a NifD2K2 e ospita un cluster aggiuntivo [4Fe-4S] per ciascuna delle due subunità NifH14,15. Pertanto, le cellule che eseguono la fissazione dell'N2 tramite Nif hanno un'elevata richiesta di Fe, S, Mo, ATP ed equivalenti riducenti.

Analisi filogenetiche di una concatenazione di proteine NifHDK indicano che i primi lignaggi evolutivi di Nif si trovano nei metanogeni idrogenotrofi6,7,8,9,16,17. Queste osservazioni sono corroborate da altri dati che indicano che NifHDK si è evoluto da una serie di duplicazioni di geni che codificano per un antenato di CfbCD8, proteine necessarie per sintetizzare il cofattore F43018,19. Il fatto che F430 (e i geni codificanti CfbCD) si trovino esclusivamente nei metanogeni archaeali (e negli alcanotrofi archaea)20 è un'ulteriore prova che indica un'origine per Nif tra gli antenati di questi Archaea. Questi dati sono stati utilizzati per suggerire un'origine per Nif tra un antenato di metanogeni anaerobici durante il Paleoproterozoico medio ~ 1,8–2,1 miliardi di anni fa (Ga)6,9,17, sebbene i dati isotopici della materia organica conservata negli scisti risalgano a > 3 Ga suggeriscono un'origine ancora precedente21,22. Indipendentemente dalla data effettiva della sua origine, la nitratosi viene interpretata come un antico enzima che ha avuto origine in un ambiente anossico sulla Terra primordiale. Un'origine anossica per questo enzima è coerente con la sensibilità all'ossigeno dei cluster metallici necessari per la funzione Nif23. Il Nif si è poi diversificato tra gli anaerobi e solo più tardi nella sua storia evolutiva è stato acquisito tramite trasferimento genico orizzontale tra organismi capaci di integrare l'ossigeno (O2) nel loro metabolismo energetico o capaci di produrre O2 nel caso dei cianobatteri. L’espansione della produttività biologica associata alla proliferazione dei cianobatteri e alla produzione di O2 avrebbe aumentato la domanda di pool abiotici esistenti di N24 fisso, che potrebbe essere stata la pressione selettiva per sviluppare un meccanismo biologico per ridurre l’N2 atmosferico e alleviare la limitazione di N7,25.

2.4 Ga)26,27. This is due to the circulation of hydrothermal fluids through iron-rich mid-ocean basalts, which led to input of a greater amount of Fe(II) into anoxic ocean basin waters than sulfide (HS-)28. In the absence of oxygen, the excess Fe(II) would have been stable, and free Fe(II) concentrations are estimated to have ranged from 0.05 to 0.5 mM29. However, the proliferation of Cyanobacteria and the production of O2 during the late Archean drove the oxidative weathering of continental sulfide minerals that increased the flux of sulfate into oceans. When combined with increased productivity near ocean margins30,31, this would have stimulated heterotrophic sulfate reduction and HS- production. In turn, this led to stratified coastal oceans that were oxygenated at the surface and were euxinic (anoxic and HS--rich) at depth30,31,32. In contrast, deeper ocean waters and those more distal from continental margins remained ferruginous26, due to lower productivity in the overlying water column, decreased availability of sulfate and subsequent heterotrophic sulfate reduction, and hydrothermal input of Fe26,33,34. HS- has a high affinity for Fe(II), resulting in the formation of low-solubility iron-sulfide minerals, including pyrite (FeS2)35,36,37. As such, in euxinic environments, concentrations of HS- exceed that of Fe(II), resulting in the titration and precipitation of Fe(II) as FeS2. Under these conditions, excess HS- is also available to complex with other thiophilic metals (e.g., Mo, Co, Ni), potentially rendering them less bioavailable33,34,38./p>

6 mM inhibits N2 fixation in stream sediments72. While this effect was attributed to the toxicity of HS- in cells responsible for N2 fixation, it is plausible that the added HS- influenced the availability of trace metals (e.g., Fe, Mo) required for N2-fixing cells62,73,74,75. A similar effect of HS- on metal availability in N2-fixing MmS2 cultures may explain the lower cell yields and increased expression of Mod genes observed in Fe(II)/HS--grown cells relative to those grown with FeS2. MoO42- is a thiophilic molecule that readily reacts with HS- to form soluble thiomolybdate (MoO4-nSn2-) species that can ultimately be incorporated in sulfide minerals, such as FeS271,76. Such thiolation reactions would be expected to occur under the sulfidic (2 mM) cultivation conditions typically used to culture methanogens77 and that were utilized herein for the Fe(II)/HS--grown cultures. These euxinic cultivation conditions potentially limited the availability of MoO42- such that it did not meet cellular demands./p>

400 nM MoO42- was required for growth with an optimum of 4000 nM42. These values are much higher than those required of other N2-fixing organisms. For example, aerobic, N2-fixing cyanobacteria such as Anabaena variabilis81, as well as anaerobic N2-fixing purple sulfur bacteria (PSB) inhabiting the interface of oxic/euxinic waters and that serves as a modern analog of the productive continental margins of Proterozoic oceans82, can be supported by less than 10 nM MoO42-. Interestingly, maximum N2 fixation for the PSB was maximal above the chemocline where HS- was near zero82. Thus, it seems incongruous that methanogens would require 40-fold more MoO42- than these organisms, despite ancestors of methanogens likely being where Nif originated6,9./p>1000 nM MoO42- was provided (Fig. 4d). Strikingly, cells provided with FeS2 grew well under all Mo concentrations tested, including when 0 µM MoO42- was added (Fig. 4c). After this experiment, abiotic reactors containing media and FeS2 (no MoO42- added) were analyzed by ICP-MS and were determined to have background (contaminant) Mo ranging from 10 to 30 nM despite using ACS-grade chemicals and acid-washed glassware. Thus, Fe(II)/HS--grown N2-fixing cells required >500 nM MoO42- to achieve near-optimal growth rates and yields whereas FeS2-grown N2-fixing cells required <30 nM MoO42-./p>10-fold lower than previously reported for this strain42. Further, MmS2 cells can achieve optimal growth rates and yields at MoO42- concentrations that are at levels ~100-fold lower than previously reported42. Despite similar growth rates for the FeS2 conditions at different MoO42- concentrations, there was a positive trend in the cell yield with increasing MoO42- that indicates higher MoO42- concentrations are still beneficial to these cells (Fig. 4d). These findings are consistent with other studies that have shown N2 fixation at low Mo concentrations with cells grown under non-sulfidic conditions81,82. Notably, the low levels (10-30 nM) of MoO42- shown to support N2 fixation herein are similar to the inferred Mo concentrations of Proterozoic oceans83,84,85). Other studies investigating Mo requirements for other methanogen species fixing N2 found 1 to 10 µM MoO42- to be the optimal concentrations86,87. There is one other example of methanogens fixing N2 at low (<10 nM) MoO42- concentrations; Nishizawa et al. showed that isolates of Methanocaldococcus and Methanothermococcus from a hydrothermal vent could fix N2 with as low as 5 nM or 1 µM MoO42-, respectively59. This indicates that different methanogen species within the same hydrothermal environment (at different temperatures) can have very different Mo requirements. Importantly, these past experiments were all performed in the presence of >1 mM HS-, necessitating a re-evaluation of methanogens’, and other anaerobes’, ability to access MoO42- in the absence of high HS-. These data support the hypothesis that N2 fixation via Nif is more efficient in low HS- conditions where Mo is more bioavailable./p> ~3 × 107 cells per mL by centrifugation in 50 mL centrifuge tubes (Globe Scientific, Mahwah, NJ) for 30 min at 4696 x g at 4 °C. The supernatant was removed using a line and needle under low-vacuum and the cells were resuspended in 8 mL of basal medium and transferred to a 15 mL centrifuge tube (Globe Scientific)./p>